【中國化工儀器網 國際新聞】來自北京大學的研究人員報道稱，他們用雙gRNAs導向CRISPR/Cas9系統抑制了乙型肝炎病毒復制。這項研究發布在近期的《World J Gastroenterol》雜志上。

        論文的通訊作者是北京大學醫學部病原生物學系魯鳳民（Feng-Min Lu）教授。其主要從事病毒性肝炎的實驗室診斷、HBV感染相關肝癌發病機制等研究。在病毒性肝炎研究方面曾獲國家科技進步二等獎一次。在包括New England Journal of Medicine、Cancer Research、American Journal of Human Genetics、Cancer Cell等雜志共發表SCI收錄研究論文約50篇。

        盡管可獲得預防性疫苗，乙型肝炎病毒（HBV）感染仍然是全球一個重要的公共健康問題。由于HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）儲存庫持續存在于肝細胞的細胞核中，當前的抗病毒藥物，包括核苷類似物（NAs）和干擾素（IFN）都只能控制HBV生成，卻無法清除HBV。NAs不能影響cccDNA，因此停止抗病毒治療的患者乙肝常常會再度復發。此外，由于HBV cccDNA的穩定性非常高而降解緩慢，因此需要終身治療慢性乙肝。另一方面，雖然在胞嘧啶脫氨和脫嘌呤/無嘧啶位點形成后IFN-α可以降解cccDNA，并進一步清除某些患者體內的病毒，其療效尚不能令人滿意。除去cccDNA是臨床治愈慢性乙肝的唯一途徑，也是慢性乙型治療中一個仍有待解決的問題。

        CRISPR/Cas9系統是源自細菌和古細菌適應性免疫系統的一種新型基因組編輯工具。CRISPR/Cas9系統可誘導靶基因組位點發生雙鏈斷裂（DSB）來促進基因組編輯。在缺乏修復模板時，DSBs是通過非同源末端連接（NHEJ）過程重新連接，這可以導致插入/缺失（indel）突變。研究人員已不僅成功應用CRISPR/Cas9系統在細胞中實現基因組編輯，還利用其破壞了病毒包括腺病毒、單純皰疹病毒（HSV）和人類免疫缺陷病毒（HIV）的基因組。就HBV來說，研究證實CRISPR/Cas9系統可以有效切割HBV A和D基因型的表達模板，A， B， C， D基因型是東亞及世界其他地區HBV主要的基因型，因此必須要設計出HBV A-D基因型特異性的向導RNAs （gRNAs）。

        在這篇文章中研究人員評估了CRISPR/Cas9系統清除HBV A-D基因型的基因組的潛力。他們總共設計出了對抗HBV A-D基因型的15種gRNAs。選出了覆蓋HBV調控區域的11個雙gRNAs組合。通過測量HBV表面抗原（HBsAg）或培養物上清液中的E抗原（HBeAg）檢測了每種gRNA和11個雙gRNAs抑制HBV（A-D基因型）復制的效力。利用PCR和測序方法檢測了在共轉染雙gRNAs和HBV表達載體的HuH7細胞中HBV表達載體的破壞情況。并利用KCl沉淀、PSAD消化、滾環擴增結合定量PCR的方法在HepAD38細胞中檢測了cccDNA的破壞情況。并評估了這些gRNAs的細胞毒性。

        結果顯示所有gRNAs都可以顯著減少培養物上清液中HBsAg或HBeAg生成，這取決于gRNA對抗的區域。所有的雙gRNAs都可以有效的抑制HBV A-D基因型生成HBsAg和/或HBeAg，與單gRNA相比，雙gRNAs抑制HBsAg和/或HBeAg生成的效力大大提高。此外，通過PCR直接測序技術，他們證實了這些雙gRNAs可通過除去兩gRNAs切割位點之間的片段來破壞HBV表達模板。更重要的是，gRNA-5和gRNA-12組合不僅可以有效抑制HBsAg和/或HBeAg生成，還能夠破壞HepAD38細胞中的cccDNA儲存庫。

        這些結果表明了，CRISPR/Cas9系統可以有效破壞HBV表達模板，且沒有明顯的細胞毒性。它有可能是在慢性HBV感染患者中根除持續存在的HBV cccDNA的一種潛在的方法。

      

(來源：生物通)